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      實戰分享|小鼠淋巴細胞的提取和分選之經驗小結

      發表時間:2023-07-28  |  點擊率:221

      脾臟是機體重要的免疫器官之一,含有大量的淋巴細胞,占全身淋巴組織總量的25%,在小鼠中,由于小鼠血液量少,從外周血液中分離大量淋巴細胞較為困難,故經常需要從其脾臟中獲取大量的淋巴細胞。


      不久前,來自華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院的李老師在Biomaterials雜志上發布的文章中就用到了上述實驗。以下為是李老師分享的一些相關經驗。


      1

      操作步驟

      1 材料準備

      選取具有正常免疫功能的成年小鼠(所需的小鼠數量根據實驗需要決定,通常一只小鼠脾臟可提取的淋巴細胞數量為2~6×107),快速斷頸處死(避免脾梗死)后,浸泡于75%酒精中;準備好已消毒的眼科剪、眼科鑷,以及一個裝有一定量PBS的無菌皿,分離脾臟后置于皿中,全程無菌操作;

      2 小鼠脾臟處理

      脾臟細胞數量較少時,可用兩個1mL無菌注射器的針尖將脾臟戳出大量的空洞后,輕輕刮取脾臟表面,將脾臟細胞刮出;數量較多時,可用細胞濾網進行研磨后離心,也可得到淋巴細胞。

      3 離心

      15mL離心管中吸入5mL ficoll分離液,傾斜管身,小心吸取含淋巴細胞的PBS緩慢加入ficoll分離液,可見明顯液體分層。600rpm梯度離心25分鐘,升速/降速均為2;

      4 二次離心

      得到分為3層的液體, 小心吸取中間層液體(含淋巴細胞+紅細胞)并置于新的15mL離心管,補滿PBS,600rpm離心5分鐘;

      5 三次離心

      棄上清PBS, 可見黑紅色沉淀,加入1~2mL紅細胞裂解液,冰上裂解5分鐘,補滿PBS, 600rpm離心5分鐘;

      6 獲取淋巴細胞

      棄上清PBS, 可見白色沉淀,此為總淋巴細胞;計數;

      7 重懸淋巴細胞

      將提前過夜包被CD3抗體(包被濃度為5ug/mL)的96孔板中的PBS吸棄,配制淋巴細胞培養基,1640全培+巰基乙醇+CD28抗體(終濃度2.5ug/mL),重懸淋巴細胞并加入96孔板,100~200ul/孔,通常淋巴細胞數量為1~3×105個/孔。通常8個小時即可看到T細胞增殖團,刺激48h后可以較好活化T淋巴細胞;

      8 分選

      若實驗目的為分選CD4/CD8 T淋巴細胞,可以省去紅細胞裂解操作,直接用磁珠抗體對淋巴細胞進行避光孵育,并用PBS洗掉多余的試劑后,棄上清,用一定量PBS重懸淋巴細胞,緩慢加入預先潤濕過的macs tube(已安裝到磁力架上)。根據具體試劑和目的可以分為陰選和陽選:陰選需要從分選柱中流下的液體,其中含有目的細胞;陽選則應該等待分選柱中的液體流盡后,將分選柱從磁力架上取下后,并重新加入PBS將分選柱中的陽選細胞沖下,其中含有目的細胞。計數,此后步驟同總淋巴細胞。


      1

      注意事項

      1

      由于整個過程需要淋巴細胞長時間處于體外PBS中,所以對PBS的要求比較嚴格;為保護淋巴細胞,也可以使用專門的淋巴細胞緩沖液,或自行配制含0.4%BSA的PBS緩沖液;

      2

      有些研究為了更好地促進淋巴細胞的殺傷功能,還會在T細胞培養基中添加IL-2; 但是,很多人認為這樣也會加速T細胞進入T細胞耗竭的進程,同時會縮短T細胞壽命;

      3

      若后續需要進行流式分析,無法再染CD3 和 CD28分子;

      4

      若用到了OT-I CD8 T細胞,則無需CD3抗體刺激,而是用OVA抗原刺激活化第一信號;

      5

      以上所有操作均以無菌試劑、耗材,無菌環境內操作為前提。


      以上為淋巴細胞提取、分選的經驗分享,希望對大家有所幫助。同時也歡迎更多老師參與文獻獎勵活動,分享您的科研干貨和心得體會!





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